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顯微鏡超薄切片技術(shù)

來(lái)源:深圳市泰宇星光電儀器有限公司   2022年05月08日 12:39  
  顯微鏡超薄切片技術(shù)制作:
 
  由于電鏡電子束穿透能力的限制,必須把標(biāo)本切成厚度小于0.1um以下的薄片才適用,這種薄片稱為超薄切片。常用的超薄切片厚度是50-70nm。(單筒顯微鏡)
 
  在透射電鏡的樣品制備方法中,超薄切片技術(shù)是最基本、的制備技術(shù)。超薄切片的制作過(guò)程基本上和石蠟切片相似,需要經(jīng)過(guò)取材、固定、脫水、浸透、包埋聚合、切片及染色等步驟。
 
  超薄切片主要步驟
 
  取材、分割
 
  固定
 
  脫水
 
  滲透、包埋
 
  超薄切片
 
  超薄切片染色
 
  1取材、分割
 
  1.1取材、分割的基本要求
 
  組織從生物活體取下以后,如果不立即進(jìn)行適當(dāng)處理,會(huì)由于細(xì)胞內(nèi)部各種酶的作用,出現(xiàn)細(xì)胞自溶現(xiàn)象。此外,還可能由于污染,微生物在組織內(nèi)繁殖使細(xì)胞的微細(xì)結(jié)構(gòu)遭受破壞。因此,為了使細(xì)胞結(jié)構(gòu)盡可能保持生前狀態(tài),必須做到快、小、準(zhǔn)、冷。
 
  (1)動(dòng)作迅速,組織從活體取下后應(yīng)在最短時(shí)間內(nèi)(爭(zhēng)取在1分鐘內(nèi)) 投入2.5%戊二醛固定液。
 
  (2)體積要小,一般不超過(guò)0.5mm×0.5mm×0.5mm。也可將組織修成1mm×1mm×2mm大小長(zhǎng)條形。因?yàn)楣潭▌┑臐B透能力較弱,組織塊如果太大,塊的內(nèi)部將不能得到良好的固定。
 
  (3)機(jī)械損傷要小,解剖器械應(yīng)鋒利,操作宜輕,避免牽拉、挫傷與擠壓。
 
  (4)操作在低溫(0℃~4℃)下進(jìn)行,以降低酶的活性,防止細(xì)胞自溶。
 
  (5)取材部位要準(zhǔn)確
 
  1.2取材方法:
 
  將取出的組織放在潔凈的韌性較大的紙上,滴一滴預(yù)冷的固定液,用新的、鋒利的刀片成“拉鋸式”將組織切下并修小,然后用牙簽或鑷子將組織塊移至盛有冷的固定液的小瓶中。如果組織帶有較多的血液和組織液,應(yīng)先用固定液洗幾遍,然后再切成小塊固定。
 
  2固定
 
  2.1固定的目的
 
  是盡可能使細(xì)胞中的各種細(xì)胞器以及大分子結(jié)構(gòu)保持生活狀態(tài),并且牢固地固定在它們?cè)瓉?lái)所在的位置上。
 
  2.2固定的方法
 
  有物理法和化學(xué)法兩大類。
 
  物理法系采用冰凍、干燥等手段來(lái)保持細(xì)胞結(jié)構(gòu);
 
  化學(xué)法是用一定的化學(xué)試劑來(lái)固定細(xì)胞結(jié)構(gòu)?,F(xiàn)通常使用化學(xué)法對(duì)組織或細(xì)胞進(jìn)行固定。
 
  2.3常用固定劑有:
 
  (1)(OsO4)
 
  是一種強(qiáng)氧化劑,與氮原子有較強(qiáng)的親和力,因而對(duì)于細(xì)胞結(jié)構(gòu)中的蛋白質(zhì)成分有良好的固定作用。它還能與不飽和脂肪酸反應(yīng)使脂肪得以固定。此外,還能固定脂蛋白,使生物膜結(jié)構(gòu)的主要成分磷脂蛋白穩(wěn)定。它還能與變性DNA以及核蛋白反應(yīng),但不能固定天然DNA、RNA及糖原。固定劑有強(qiáng)烈的電子染色作用,用它固定的樣品圖象反差較好。鋨固定的時(shí)間一般為1-2小時(shí)。
 
  (2)戊二醛 (C5H8O2)
 
  戊二醛的優(yōu)點(diǎn)是對(duì)糖原、糖蛋白、微管、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細(xì)胞基質(zhì)等有較好的固定作用,對(duì)組織和細(xì)胞的穿透力比強(qiáng),還能保存某些酶的活力,長(zhǎng)時(shí)間的固定(幾周甚至1~2個(gè)月)不會(huì)使組織變脆。缺點(diǎn)是不能保存脂肪,沒(méi)有電子染色作用,對(duì)細(xì)胞膜的顯示較差。
 
  組織塊固定常規(guī)采用戊二醛—鋨酸雙重固定法。分前固定和后固定,中間用磷酸緩沖液漂洗。前固定用2.5%戊二醛固定2小時(shí)以上、后固定用1%鋨酸固定液固定1~
 
  2小時(shí),pH7.2~7.4。固定完畢,用緩沖液漂洗20分鐘后進(jìn)行脫水。
 
  3脫水
 
  為了保證包埋介質(zhì)*滲入組織內(nèi)部,必須事先將組織內(nèi)的水分驅(qū)除干凈,即用一種和水及包埋劑均能相混溶的液體來(lái)取代水,常用的脫水劑是乙醇和丙酮。
 
  急驟的脫水會(huì)引起細(xì)胞的收縮,因此,脫水應(yīng)梯度進(jìn)行:15% 乙醇15分鐘,30%乙醇15分鐘,50%乙醇15分鐘, 70%
 
  乙醇15分鐘,85%乙醇15分鐘,95%乙醇15分鐘,99%乙醇10分鐘(二次)。游離細(xì)胞可適當(dāng)縮短脫水時(shí)間。過(guò)度脫水不僅引起更多物質(zhì)的抽提,而且會(huì)使樣品發(fā)脆,造成切片困難。
 
  4滲透和包埋
 
  4.1滲透
 
  滲透就是利用包埋劑滲入到組織內(nèi)部取代脫水劑的過(guò)程,這種包埋劑在單體狀態(tài)時(shí)(聚合前)為液體,能夠滲入組織內(nèi),當(dāng)加入某些催化劑,并經(jīng)加溫后,能聚合成固體,以便進(jìn)行超薄切片。
 
  目前常用的包埋劑是環(huán)氧樹(shù)脂(epoxyresin)。環(huán)氧樹(shù)脂是一類高分子聚合物,它的分子中含有兩種反應(yīng)基團(tuán),即環(huán)氧基和羥基。當(dāng)加入酸酐類時(shí),樹(shù)脂分子中的羥基能與酸酐結(jié)合,形成分子間的橫橋連接,這種起橫橋式連接作用的交聯(lián)劑叫做硬化劑,它們參與交聯(lián)反應(yīng),并被吸收到樹(shù)脂鏈中。常用的硬化劑有十二烷基琥珀酸酐(或叫十二碳烯基丁二酸酐,簡(jiǎn)稱DDSA)、甲基內(nèi)次甲基鄰苯二甲酸酐(或叫六甲酸酐,簡(jiǎn)稱MNA)及順丁烯二酸酐等。
 
  當(dāng)加入胺類時(shí),就引起末端環(huán)氧基相連,形成首尾相接的長(zhǎng)鏈狀聚合物。這種促進(jìn)末端相接的交聯(lián)劑叫做催化劑或加速劑。常用的加速劑有2,4,6-三(二甲氨基酚)(簡(jiǎn)稱DMP(30)、二乙基苯胺及乙二胺等。為了改善包埋塊的切割性能,某些環(huán)氧樹(shù)脂包埋劑配方中還加有增塑劑,使包埋塊具有適當(dāng)?shù)捻g性。常用的增塑劑為鄰苯二甲酸二丁酯(簡(jiǎn)稱DBP)。
 
  4.2包埋
 
  包埋操作:常規(guī)將組織塊包埋在多孔橡膠包埋模板中,然后置烤箱烘干,在45℃(12小時(shí))、60℃(24-36小時(shí))烤箱內(nèi)加溫,即可聚合硬化,形成包埋塊。
 
  包埋操作中應(yīng)注意以下幾點(diǎn):
 
  (1)所有試劑要防潮,存放在干燥器中;
 
  (2)所用器皿應(yīng)烘干;
 
  (3)配包埋劑時(shí),每加入一種試劑要攪拌均勻;
 
  (4)包埋時(shí)動(dòng)作要輕巧,防止產(chǎn)生氣泡;
 
  (5)皮膚盡量不要接觸包埋劑,以免引起皮炎;
 
  (6)盛放過(guò)包埋劑的容器要及時(shí)用丙酮清洗干凈。
 
  5超薄切片
 
  5.1修塊
 
  一般用手工對(duì)包埋塊進(jìn)行修整。將包埋塊夾在特制的修塊器上或拿在手中,在明亮處或放在解剖鏡下,用什錦銼或鋒利的刀片先銼或削去表面的包埋劑,露出組織,然后在組織的四周以和水平面成45度的角度削去包埋劑,修成錐體形。
 
  5.2半薄切片定位
 
  利用超薄切片機(jī)切厚度為1μm-10μm的切片,稱厚切片或半薄切片。將切下的片子用鑷子或吸管轉(zhuǎn)移到干凈的事先滴有蒸餾水的載玻片上,加溫,使切片展平,干燥后經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色,光學(xué)顯微鏡觀察定位。
 
  半薄切片進(jìn)行光學(xué)顯微鏡觀察的目的:(微生物顯微鏡)
 
  (1)定位:通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察,確定所要觀察的范圍,然后保留要用電鏡觀察的部分,修去其余部分。
 
  (2)便于對(duì)同一組織的同一部位進(jìn)行光學(xué)顯微鏡和電鏡的對(duì)比觀察。半薄切片定位以后,要對(duì)包埋塊作進(jìn)一步的修整。通常將塊的頂端修成金字塔形,頂面修成梯形或長(zhǎng)方形,每邊的長(zhǎng)度為0.2mm~0.3mm。
 
  5.3制刀超薄切片使用的刀有兩種:一種是玻璃刀,另一種是鉆石刀。由于玻璃刀價(jià)格便宜,使用者較多。制刀用的玻璃為硬質(zhì)玻璃,厚度為5mm~6.5mm。
 
  玻璃刀用制刀機(jī)制作。制好玻璃刀后,要圍繞刀口制作一只水槽,以便使超薄切片漂浮在水面上。水槽有塑料水槽和膠布水槽兩種。塑料水槽有固定的形狀,可反復(fù)使用。膠布水槽是臨時(shí)用膠布或?qū)S盟芰蠗l制作的。裝好水槽后,用熔化的石蠟封固接口,防止漏水。
 
  5.4載網(wǎng)和支持膜.(1) 載網(wǎng)
 
  電鏡中使用的載網(wǎng)有銅網(wǎng)、不銹鋼網(wǎng)、鎳網(wǎng)等,一般常用銅網(wǎng)。載網(wǎng)為圓形,直徑3mm。網(wǎng)孔的形狀有圓形、方形、單孔形等。網(wǎng)孔的數(shù)目不等,有100、200、300目等多種規(guī)格,可根據(jù)需要進(jìn)行選擇。
 
  (2)支持膜的制備
 
  挑選并清洗好載網(wǎng)之后,要在載網(wǎng)上覆蓋一層薄膜,這層薄膜稱支持膜,厚度為10nm~20nm。對(duì)支持膜的要求是透明無(wú)結(jié)構(gòu),并能承受電子束的轟擊。常用的支持膜有火棉膠膜及縮甲醛膜(formvar膜),一般采用后者。
 
  5.5超薄切片機(jī)
 
  超薄切片需用超薄切片機(jī)進(jìn)行。
 
  5.5.1超薄切片機(jī)分類
 
  根據(jù)推進(jìn)原理不同,將超薄切片機(jī)分為兩大類:
 
  (1)機(jī)械推進(jìn)式切片機(jī),用微動(dòng)螺旋和微動(dòng)杠桿來(lái)提供微小推進(jìn);
 
  (2)熱脹冷縮式切片機(jī),利用金屬桿熱脹或冷縮時(shí)產(chǎn)生的微小長(zhǎng)度變化來(lái)提供推進(jìn)。
 
  5.5.2超薄切片的步驟包括:(金相顯微鏡)
 
  (1)安裝包埋塊;
 
  (2)安裝玻璃刀;
 
  (3)調(diào)節(jié)刀與組織塊的距離;
 
  (4)預(yù)切片;
 
  (5)換切片刀重新調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)刀與組織塊的距離;
 
  (6)水槽液面高度與燈光位置;
 
  (7)調(diào)節(jié)切片厚度及切片速度,切片;
 
  (8)將切片撈在有支持膜的載網(wǎng)上。
 
  5.5.3超薄切片厚度的判斷
 
  干涉色厚度
 
  暗灰色<40nm
 
  灰色40nm~50nm
 
  銀色50nm~70nm
 
  金色70nm~90nm
 
  紫色80nm~150nm
 
  6超薄切片的染色
 
  未經(jīng)染色的超薄切片,反差很弱。因此,要進(jìn)行染色處理,以增強(qiáng)樣品的反差。
 
  一般是用重金屬鹽與組織細(xì)胞中某些成分結(jié)合或被組織吸附來(lái)達(dá)到染色的目的。重金屬的原子對(duì)電子束形成散射,從而提高圖象的反差。
 
  常用的染色劑有醋酸鈾和檸檬酸鉛。染色方法有兩種:
 
  (1)組織塊染色
 
  在脫水至70%乙醇時(shí),將組織塊放在用70%乙醇配制的飽和醋酸鈾溶液中,染色時(shí)間2小時(shí)以上,或在冰箱中過(guò)夜。
 
  (2)切片染色(生物顯微鏡)
 
  預(yù)先取一個(gè)清潔的培養(yǎng)皿,將石蠟溶解制作成蠟板,然后滴數(shù)滴染液于蠟板上,用鑷子夾住載網(wǎng)的邊緣,把貼有切片的一面朝下,使載網(wǎng)浮在液滴上,蓋上培養(yǎng)皿,染色10~20分鐘。載網(wǎng)從染液中取出后,必須盡快用蒸餾水清洗干凈。
 
  在染色過(guò)程中,鉛染液容易與空氣中的二氧化碳結(jié)合形成碳酸鉛顆粒,而污染切片。因此,在保存和使用染液時(shí),要盡量減少與空氣的接觸。為防止鉛沉淀污染,可在培養(yǎng)皿內(nèi)放置氫氧化鈉顆粒,以吸收空氣中的二氧化碳。

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